O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos (blocos que constituem a molécula de DNA) em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.

Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” ou de “Sanger”; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano. Sua estratégia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permita detecta-los na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa” (fig 1).

FIG 1

A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de 3’-desoxinucleotídeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ou ; um dos mais utilizado é o dATP³²P (fig 2a). Como a enzima utilisada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação, de um pequeno fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade 3’ do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no local mencionado, e fornecerão um ponto de partida para a replicação do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou “primer", quando marcado, poderá ser utilizado para rastrear o fragmento de DNA recém sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo é que ele é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de análogo, 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos (ddNTPs) (fig 2b).

FIG 2

Estes análogos conhecidos como “terminadores” quando incorporados à cadeia nascente, por não apresentarem 3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser adicionado, bloqueará todo processo. Como todos os nucleotídeos normais (dNTPs) estão presentes, o alongamento da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA-polimerase insira um análogo (ddNTP). Consequentemente, haverá parada imediata da reação de síntese no ponto em que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula estará marcada com ³²P. Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente: um canal de análise para cada reação. O gel é “transferido” para um suporte de nitrocelulose (filtro).
Após auto-radiografia a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta é complementar à da molécula sequenciada: que serviu de “molde”. Levando estas observações em consideração, é possível conhecer a sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’para 5’ partindo-se da parte inferior para a superior do gel. O resultado e as etapas do processo descrito acima, frequentemente mostrado em fotografias nos livros especializados, podem ser observados no esquema da Fig. 3.

FIG 3

O método pode ser automatizado através de “maquinaria apropriada” gerenciada por computadores com “softs” que lêm sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitirá executar o processo em grande escala. Neste caso utilizam-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescência fig 4a. Como cada reação (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um único canal do gel de sequenciamento fig 4b. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda. A luz emitida é detectada por “escaneamento” do gel e a sequência deduzida por computador fig 4c. Variáveis mais modernas, consequentemente mais rápidas e poderosas, incluem a robotização total do processo com a inclusão das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA

FIG 4