Reação em Cadeia pela Polimerase
(PCR)

_O fato central que faz a PCR tão útil é que todo organismo vivo possui sequências de nucleotídeos no DNA que são únicas e específicas para cada espécie. A técnica explora função natural da enzima chamada de taq- polimerases, extraída da bactéria Thermus aquaticus. Através da PCR é possível obter-se cópias de uma parte do material genético em quantidade suficiente que permita detectar e analisar a sequência que é alvo do estudo. Às vezes referida como “fotocópia molecular”, a PCR pode amplificar qualquer sequência específica de DNA, a partir de amostras de diferentes materiais biológicos como sangue, urina e outros fluidos corporais, cabelo e cortes de tecidos (biópsias frescas ou em blocos de parafina). Amostras de microorganismos, células animais ou vegetais, alguns deles com milhares, possivelmente até milhões, de anos de idade podem, também, ser detectadas.

_Para a execução da técnica da PCR é preciso que se tenha conhecimento prévio da sequência do ácido nucléico que se deseja amplificar, dita “sequência alvo.” A partir disto, desenham-se dois iniciadores (“primers”) para dar partida ao processo de síntese em um local específico.Um “primer” serve para sintetizar a sequência alvo no sentido 3’- 5’e outro para o sentido inverso isto é, 5’-3.’ O “primer” é uma pequena sequência de nucleotídeos que hibridiza no início da sequência alvo que se quer amplificar e da qual ele é complementar. Ao reconhecer o “primer,” a polimerase sintetiza uma cópia complementar, obedecendo à informação contida na sequência de DNA que será replicada (sintetizada). A PCR precisa ainda de deoxinucleosídeos trifosfatados (dATP; dTTP; dGTP; dCTP) que são quatro componente químicos diferentes que atuam como se fossem tijolos na construção da molécula de DNA.

-> O primeiro passo para a realização de um PCR é a coleta da amostra biológica. Para tanto, é importante levar em consideração o que se deseja pesquisar. Por exemplo: se um paciente apresenta uma lesão na pele, deve ser recolhida uma amostra da mesma e não do sangue do paciente.

-> O segundo passo consiste em extrair o DNA a partir do material coletado. Esta extração segue um critério de metodologia básico, que varia dependendo da amostra utilizada. Basicamente utilizam-se substâncias desproteinizantes como o fenol-clorofórmio, capazes de desnaturar e retirar as proteínas que estão acopladas ao DNA. A adição posterior de etanol, então, fará com que o material genético precipite no tubo que posteriormente será solubilizado em tampão apropriado para o uso na reação.

-> O terceiro passo consiste em preparar a mistura de reação. A mistura de reação contém as substâncias necessárias para fazer novas cópias de DNA no processo da PCR. Então, dentro de um tubo são colocados:

1) solução tampão para manter a mistura de reação no pH e condições iônicas ideais para a reação.
2) os deoxinucleotídeos já mencionados;
3) os “primers.”
4) a Taq Polimerase
5) o DNA extraído da amostra.

-> O quarto passo consiste na reação em si que é feita em uma máquina especial, chamada de termociclador, que aquece e resfria o tubo em vários ciclos consecutivos para amplificar o DNA.
Primeiramente, o tubo é aquecido a 90-96 graus para que o DNA seja desnaturado (separaçào das fitas). Em seguida, a temperatura do termociclador diminui para permitir a hibridização ou anelamento; nesta fase, os “primers” se ligam, especificamente, às suas sequências complementares no DNA. A próxima etapa é a síntese pela polimerase. Após diversos ciclos (geralmente em torno de 30 ciclos) o DNA estará amplificado em milhões de cópias. (VEJA O FILME PARA MELHOR ENTENDER O PROCESSO)